狗狗冠状病是什么？
冠状病毒是犬猫的一种急性消化道感染传染病，其传染性强、传播途径多，一年四季都可以发生，但以季节交替时发病率较高[1]，临床以腹泻为主症。该病在临床上与细小病毒病、传染性肠炎及胃肠炎不易区别，易造成误诊和漏诊；且该病死亡率较高，给养宠户带来很大的经济损失和心理的压力。 为了研究本病的流行病学特征及其发病机制，我们于2014年3月-9月在江西省某宠物医院收集了67例患冠状病毒感染的动物病例的粪便标本进行流行病学分析，并选取其中28份粪便标本分离培养病毒的致病性、流行毒株的基因特性进行了深入研究。
一、病例来源 本研究来源于本院临床诊断的67例患冠状病毒感染动物病例的粪便标本，采集地点为江西地区多家宠物医院就诊病例粪便样本，全部病例经实验室检测确诊为犬冠状病毒阳性粪便（结果另文公布）。 二、材料与方法
（一）试验材料
1. 主要试剂：Trizol试剂盒购自Invitrogen公司;AMV逆转录酶、dNTPs、RT-PCR缓冲液等为Promega产品;琼脂糖为Bio-Rad产品;DNA凝胶回收试剂盒购自Tiangen公司;PCR引物由上海英沃生物技术有限公司合成；其他化学试剂均为国产分析纯级。
2. 培养基：犬小肠上皮细胞系EGC-1细胞由日本熊本大学兽医药学部金井清教授提供，培养基为LHBS(美国Sigma公司);MEM培养基为基础培养基，含小牛血清5%、青霉素/链霉素各100U/mL;DMEM培养基基础培养基中含2mmol/L谷氨酰胺，其余成分同MEM培养基[6]; 0.25%(质量分数)胰蛋白酶溶液。
3. 实验动物：6~8周龄BALB/c小鼠，SPF级，体重(18±2)g，雌雄各半，由北京大学医学部动物科学研究所提供。
（二）方法 [6]
1. EGC-1细胞复苏：将存放在－196℃冰箱中的冻存细胞用含5%CO2、温度为37℃的空气预融，将其移置37℃水浴中直至全部融化。用0.02 mmol/L的胰蛋白酶悬浮细胞，调整细胞浓度至5×105个/mL后接种至培养瓶内，置于37℃、5%二氧化碳孵箱中静置培养过夜。次日更换新鲜培养基继续培养。
2. 病毒感染细胞的传代：分别取生长良好的第1～6代细胞，离心洗涤两次后加入无血清的培养基重悬。向每毫升细胞悬液中加入0.25 %胰蛋白酶溶液0.2 mL，37℃消化约5min，显微镜下观察当半数以上细胞开始收缩变圆时停止消化。加培养基终止消化，轻轻吹打混匀制成细胞悬液，按1：3比例传代培养。
3. 病毒株的制备：采用EGC-1细胞传代数递增法，即取第1代、第4代细胞单层接种于培养瓶中，37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，待单层细胞融合率达到80%左右时，将感染复数(MOI)设为0.01的细胞上清液转种至第2代细胞单层培养，重复上述过程，直至MOI增至20～50，收获病毒液备用或贮存于－80℃。
4. 小鼠感染毒力的测定：根据参考文献[5，6]，取第3代细胞单层培养至融合率达80%左右，弃去上清液，再加入5 mL DMEM培养液。每孔加毒液0.1 mL，同时设空白对照组、感染复数MOI=0.01和MOI=0.1的细胞培养液阳性对照组和生理盐水阴性对照组，每组3孔。接种后2h换液一次，继续置于37℃、5%二氧化碳培养箱培养，每天观察细胞病变现象(CPE)。从感染后第2天起连续观察每日的CPE程度，记录细胞病变情况，确定感染病毒后的最佳感染时间。
5. 病毒培养液的收集：感染病毒2 d后，吸出空培养板内的培养液，加入含有0.25%胰蛋白酶溶液的新鲜培养基，振荡使胰酶均匀分布。37℃消化约5 min，每隔2 min震荡一次，待细胞溶解完全后，取出培养板，用培养基冲洗2次。将洗出的细胞悬浮液转移至1.5 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，去除残余的胰蛋白酶，收集上层液体待用。
6. RT-PCR扩增： 按照Trizol试剂盒说明书提取肠道病毒RNA， 引物依据GenBank公布的GCC病毒株序列设计。正向引物：5'-GTGGACTTATACTCAACCATTAAAGC-3';反向引物：5'-TAGCTTTCACAACCGGAATCAAA-3'，扩增片段长度约为244 bp。 反应体系为50 μL：Taq DNA聚合酶1 U，上游引物P1 1 μM，下游引物 P2 1μ M ，dNTPs 4μ L，5 X Taq buffer 10 μ L，模板RNA 5 μ L，ddHzO 19 μ L，PCR reaction条件如下： 95℃预变性5min，然后按以下程序循环35次： 95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min。最后72℃延伸10 min。
7. PCR产物的克隆以及测序鉴定：按DNA凝胶回收试剂盒说明对目的基因片段进行纯化，然后将纯化的片断连接到PMD19-T载体上进行克隆转化。挑选阳性克隆菌送至上海英沃生物有限公司，由该公司进行序列测定。
三、统计学处理 用 SPSS13.0软件包进行统计分析